جهت جداسازی نماتدها از خاک و محیط های دیگر ( اعم از بدن حشرات و بافت های گیاهان) از سه روش زیر میتوان استفاده کرد:
- سانتریوفیوژ یا شناورسازی در قند Centrifuge or sugar flotation method
- قیف بیرمن Baermann funnel method
- الک سازی Sieving method
سانتریوفیوژ یا شناورسازی در آب قند
- ابتدا خاک را به صورت دوغاب در آورده و از الک درشت به قطر منافذ 2-3 میلیمتر عبور می دهیم .
- سوسپانسیون خاک را به ترتیب از الک های 45 مش ( μm 355) ، 60 مش( μm 250 ) ، 100 مش ( μm 150 ) و 400 مش (μm 37 ) عبور می دهند.
(مش: Mesh : به تعداد منافذ موجود در یک اینچ طول ( 54/2 سانتی متر) اطلاق می گردد.)
- سوسپانسیون بر جای مانده در الک 400 مش را در استوانه مدرج به حجم 1000 یا 500 سی سی ریخته و به مدت 30-20 دقیقه صبر می کنیم تا ذرات سبک ( خار و خاشاک و هوموس ) خاک در سطح سوسپانسیون جمع شوند.
- پس از این مدت، ذرات سبک جمع شده بر سطح آب را از سوسپانسیون جدا می کنیم. برای اینکار می توان مقدارکمی آب به استوانه مدرج اضافه کرد تا ذرات سبک سطح سوسپانسیون به آرامی شسته شوند.
- به میزان 300-500 سی سی از قسمت ته نشین شده در استوانه مدرج را برداشته و پس از همگن کردن به طورمساوی در تیوپ های سانتریفیوژ می ریزیم. می توان پس از جدا کردن ذرات سبک از سطح سوسپانسیون، مجدداً محتویات استوانه مدرج را در الک 400 مش ریخته و محتویات الک 400 مش را در یک بشر جمع آوری می کنیم .با این کار حجم سوسپانسیون کاهش یافته و سپس به تیوب های سانتریفیوژ منتقل می کنیم. تیوب های سانتریفیوژ باید دو به دو ، وزن یکسانی از سوسپانسیون را دریافت کنند.
- سانتریفیوژ را به مدت 5 دقیقه به 5000 دور در دقیقه جهت آبگیری از نمونه ها انجام می دهیم می توان میزان دور را کم و در مقابل زمان سانتریفیوژ را بیشتر کرد.
- پس از پایان سانتریفیوژ آب روی لوله ها را دور ریخته(بهتر است روی الک 400 مش خالی کنیم ) و به جای آب به لوله ها محلول آب شکر به جرم حجمی 18/1 اضافه می کنیم.
- برای تهیه محلول آب شکر به جرم حجمی 18/1 ، در یک استوانه مدرج به حجم 1000 سی سی، 700 cc آب ریخته و آنقدر شکر اضافه می کنیم تا حجم محلول به 1000 برسد. نسبت آب و شکر باید 300 به 700 باشد.
(در سانتریفیوژ ، تیوب ها را حداکثر تا 3/2 حجم آن ها از سوسپانسیون خاک یا آب شکر پر می کنیم)
- پس از اضافه کردن آب شکر و تنظیم وزن تیوب های مقابل هم ، محتویات تیوپ را همگن کرده و در دستگاه سانتریفیوژ قرار می دهیم.
- عمل سانتریفیوژ را به مدت یک دقیقه با سرعت هزار دور در دقیقه انجام می دهیم.
- بلافاصله پس از اتمام سانتریفیوژ، تیوب ها را از دستگاه خارج و محتویات رویی آن ها را در الک 400 مش خالی می کنیم. همزمان جهت شسته شدن شکر، شیر آب را روی الک باز می کنیم.
- نهایتاً محتویات الک 400 مش را در یک پتری ریخته و زیر بینوکولر مشاهده می کنیم .
روش قیف بیرمن
برای جداسازی نماتدهای موجود در خاک ، بدن حشرات . گیاه میزبان می توان استفاده کرد.
مراحل به شرح زیر می باشد :
- انتهای یک قیف شیشه ای را به یک لوله پلاستیکی به قطر 20-10 سانتی متر وصل می کنیم و انتهای لوله را با یک گیره مسدود می کنیم.
- در محل قیف یک توری فلزی یا پلاستیکی(درحدود 10 مش یا کمتر) قرار می دهیم، قیف را تا زیر توری از آب پر می کنیم.
- یک لایه نازک از دستمال کاغذی یا پارچه با منافذ نسبتاً ریز روی توری قرار می دهیم.
- روی پارچه یا دستمال کاغذی مقداری خاک یا خرد شده ی گیاهان یا حشرات را می ریزیم .
- نماتد های موجود در خاک یا نمونه به درون آب شنا کرده و با گذر از پارچه یا دستمال کاغذی وارد لوله میشود.پس از 14 ساعت می توان نماتدها را استخراج کرد.
- قرار دادن یک لامپ روشن روی قیف سبب حرکت سریع تر نماتدها به طرف پایین قیف می گردد.
- می توان به جای قیف از صفحات بزرگتر توری که دارای یک صفحه سینی مانند در زیر خود هستند استفاده کرد.
- در این روش غالباً نماتدهای آزاد و بسیار فعال و زنده از منافذ دستمال کاغذی یا پارچه عبور کرده و به دست می آیند و در مقابل نماتدهای مرده و کم تحرک مانند اغلب نماتدهای گیاهی از منافذ عبور نمی کنند.
روش الک کردن
اساس کار بر این است نمونه ای کوچک از خاک ، مثلا ۳۰۰ سانتی متر مکعب ، با مقداری بیشتری از آب مخلوط میشود .نماتد ها در آب شناور میشوند و میتوان آنها را روی الک هایی با اندازه سوراخ های مناسب جمع آوری کرد. برای این کار ، ابتدا مخلوط آب و خاک بهم زده میشود و برای ۳۰ ثانیه بی حرکت باقی می ماند .آب بالای سطل از داخل الک ۲۰ مش گذرانده میشود .این الک قطعات بزرگ مواد را نگه میدارد و نماتد ها را به درون سطل دیگری رد میکند.
آب حاوی نماتد ها سپس از الک ۶۰ مش رد میشود که نماتدهای بزرگتر و بخشی از ذرات مواد را جمع می کند ، اما نماتدهای ریزتر را به داخل سطل دیگری عبور میدهد . این نیز از الک ۲۰۰مش عبور داده می شود که نماتد های ریز و دیگر مواد هم اندازه را می گیرد. هر دو الک ۶۰ و ۲۰۰ مش ، دو یا سه بار شستشو داده میشوند که مواد زاید هرچه بیشتر حذف شوند و در پایان ، نماتد ها به درون ظرفی ریخته می شوند تا بیشتر جداسازی یا مستقیما بررسی شوند.
